Giới thiệu về Kính hiển vi quét Laser

Giới thiệu về Kính hiển vi quét Laser

Kính hiển vi quét laser sử dụng chiếu sáng laser để tạo ra hình ảnh 3D có độ phân giải cao, độ tương phản cao của mẫu bằng cách quét từng điểm một. Hai loại kính hiển vi quét laser phổ biến bao gồm kính hiển vi quét laser cộng hưởng và kính hiển vi quét laser đa quang. Mặc dù cả hai đều sử dụng laser để kích thích mẫu, nhưng có một số điểm khác biệt chính giữa chúng. Ở đây, chúng tôi sẽ giải thích cách thức hoạt động của cả kính hiển vi quét laser cộng hưởng và kính hiển vi quét laser đa quang, cũng như cách sử dụng và các loại hình ảnh mà chúng có thể tạo ra.

               Kính hiển vi quét laser cộng hưởng                                                          Kính hiển vi quét laser đa quang tử

Nguyên lý của Kính hiển vi quét laser cộng hưởng

Kính hiển vi quét laser cộng hưởng hoạt động bằng cách sử dụng tia laser sóng liên tục (CW) bước sóng ngắn để tạo ra ánh sáng kích thích cường độ cao để chiếu sáng mẫu. Tia laser này được phản xạ từ một gương lưỡng sắc và sau đó là hai gương nữa, lần lượt quét tia laser qua mẫu nhuộm. Khi được kích thích bởi tia laser, thuốc nhuộm trong mẫu sẽ phát huỳnh quang và phát ra ánh sáng bước sóng dài được khử quét bởi các gương đã sử dụng trước đó để quét ánh sáng kích thích. Ánh sáng phát ra sau đó đi qua gương lưỡng sắc, tại đó nó được hội tụ vào một lỗ kim và được thu thập và đo lường bởi máy dò. Máy dò được kết nối với máy tính để tạo ra hình ảnh 3D kỹ thuật số theo từng điểm. Vì lỗ kim chặn mọi huỳnh quang ngoài tiêu điểm nên hình ảnh được tạo ra có độ chi tiết cao. Nguyên lý của kính hiển vi quét laser cộng hưởng là cả tia laser và máy dò đều hội tụ vào cùng một điểm trên mẫu và điểm này dịch chuyển để cuối cùng tạo ra hình ảnh hoàn chỉnh của mẫu.

Nguyên lý của Kính hiển vi quét laser đa quang

Kính hiển vi quét laser đa photon hoạt động theo cách rất giống với kính hiển vi quét laser cộng hưởng. Tuy nhiên, trong khi kính hiển vi quét laser cộng hưởng sử dụng tia laser có bước sóng ngắn để kích thích mẫu, thì kính hiển vi quét laser đa photon sử dụng tia laser xung hồng ngoại (IR) femto giây phát ra ở bước sóng dài gấp hai lần so với bước sóng cần thiết để kích thích một photon. Khi thuốc nhuộm trong mẫu hấp thụ hai photon cùng lúc, nó có thể phát huỳnh quang. Hiện tượng hấp thụ hai photon này chỉ xảy ra ở vị trí tiêu điểm, nơi mật độ photon tập trung cao và chỉ thuốc nhuộm tại điểm tiêu điểm mới có thể bị kích thích và phát huỳnh quang. Do đó, hệ thống kính hiển vi quét laser đa photon không yêu cầu khẩu độ lỗ kim để chặn huỳnh quang ngoài tiêu điểm cho máy dò không quét (NDD) của nó và huỳnh quang từ điểm tiêu điểm có thể được phát hiện hiệu quả. Lý do cho phương pháp kích thích thay thế là tia laser có bước sóng dài hơn có thể xuyên sâu vào mô, giúp có thể quan sát và chụp ảnh ở độ sâu hàng trăm micromet trong thể tích mô sống. Hơn nữa, độc tính với ánh sáng giảm so với tia laser có bước sóng ngắn. Do đó, kính hiển vi quét laser đa quang phù hợp hơn cho việc nghiên cứu tế bào và mô sống ở động vật sống trong cơ thể sống.

Sử dụng kính hiển vi quét laser

Kính hiển vi quét laser cộng hưởng có lợi ích rất lớn trong nhiều lĩnh vực , mặc dù chúng thường được sử dụng nhất trong nghiên cứu sinh học . Chúng thường được sử dụng trong nghiên cứu sinh học tế bào , nghiên cứu ung thư và nghiên cứu tế bào gốc , vì khả năng tạo hình ảnh 3D cực kỳ chi tiết của tế bào của kính hiển vi quét laser cộng hưởng, cho phép người quan sát nhìn vào bên trong mẫu được quét. Điều này là do kính hiển vi quét laser cộng hưởng có thể cắt quang học ánh sáng để tạo ra hình ảnh có độ phân giải cao của các mẫu mô dày mà không cần phải cắt mẫu vật lý. Nhờ khả năng thâm nhập sâu của tia laser xung IR femto giây, kính hiển vi quét laser đa photon hoạt động tốt nhất để chụp ảnh động vật sống trong cơ thể sống. Do đó, chúng thường được chọn cho nghiên cứu khoa học thần kinh và nghiên cứu ung thư.

Ưu điểm và nhược điểm của kính hiển vi quét laser

Kính hiển vi quét laser đã trở thành một phần không thể thiếu trong nghiên cứu tế bào và mô sinh học, một phần không nhỏ là nhờ khả năng quét mẫu vật từng điểm một. Những lợi thế khác của kính hiển vi quét laser cộng hưởng bao gồm khả năng tạo hình ảnh 3D có độ phân giải cao, độ tương phản cao của tế bào và mô mà không cần phải cắt mẫu vật lý.

Lý do kính hiển vi quét laser có thể tạo ra hình ảnh chất lượng cao như vậy là vì chúng rất hiệu quả trong việc loại bỏ ánh sáng huỳnh quang không lấy nét qua lỗ kim cộng hưởng để máy dò chỉ thu thập được một điểm hội tụ tại một thời điểm.

Cũng vì lý do này, có thể mất nhiều thời gian để biên soạn một hình ảnh 3D hoàn chỉnh của một mẫu vật. Tuy nhiên, có những tiến bộ trong thiết bị hiện có giúp đẩy nhanh quá trình này. So với quét bằng máy đo điện kế truyền thống, quét cộng hưởng có thể cung cấp hình ảnh tốc độ cao hơn lên đến 30 khung hình/giây để quan sát các sự kiện động, nhanh như dòng máu hoặc dòng ion trong tế bào.

Quét Laser so với Đĩa Quay

Một ví dụ về tiến bộ công nghệ giúp tăng tốc khả năng thu thập điểm-theo-điểm của kính hiển vi quét laser là sự ra đời của đĩa quay. Kính hiển vi cộng hưởng đĩa quay  liên quan đến số lượng lỗ kim được sử dụng để chặn ánh sáng huỳnh quang ngoài tiêu điểm. Trong khi kính hiển vi quét laser cộng hưởng sử dụng một lỗ kim duy nhất, kính hiển vi cộng hưởng đĩa quay sử dụng một đĩa mờ đục với hàng trăm lỗ kim quay với tốc độ cao. Điều này cho phép chụp toàn bộ mẫu vật cùng một lúc thay vì từng điểm một. Điều này cũng có thể giúp giảm hư hỏng do ánh sáng và hiện tượng tẩy trắng do ánh sáng.

Hình ảnh kính hiển vi quét laser

Như đã đề cập, độ phân giải và độ tương phản cao của hình ảnh kính hiển vi quét laser cộng hưởng là do nó loại bỏ ánh sáng huỳnh quang không hội tụ qua lỗ kim trước khi đến máy dò. Sau khi hình ảnh 3D được tạo ra, người quan sát có thể thao tác và thậm chí khám phá bên trong hình ảnh trong một số trường hợp nhất định.

Kính hiển vi quét laser so với kính hiển vi điện tử quét

Mặc dù có tên gọi tương tự, nhưng điểm khác biệt chính giữa kính hiển vi quét laser và kính hiển vi điện tử quét là phương pháp chiếu sáng mẫu. Trong khi kính hiển vi quét laser sử dụng laser kích thích hoặc nhiều laser, thì kính hiển vi điện tử quét, như tên gọi của nó, chiếu xạ mẫu bằng chùm electron. Các electron phản xạ hoặc electron thứ cấp từ bề mặt mẫu tạo ra các tín hiệu về địa hình hoặc thành phần của mẫu, được thu thập bởi máy dò. Vì mẫu phải ở trong chân không nên không thể áp dụng kính hiển vi điện tử quét để quan sát các mẫu sống.

Độ phóng đại của kính hiển vi quét laser

Kính hiển vi quét laser có thể được sử dụng với nhiều loại vật kính có độ phóng đại khác nhau. Do đó, độ phóng đại tối đa của kính hiển vi quét laser phụ thuộc vào vật kính đang sử dụng. Vật kính có độ phóng đại thấp là lý tưởng để chụp cấu trúc của toàn bộ mẫu mô. Nếu bạn cần chụp hình thái của các tế bào tạo nên mô, vật kính có độ phóng đại trung bình là đủ. Sau đó, có thể sử dụng vật kính có độ phóng đại cao để xem cấu trúc vi mô bên trong các tế bào tạo nên mô.