kính hiển vi huỳnh quang là gì? Giới thiệu về kính hiển vi huỳnh quang

Giới thiệu sơ lược về kính hiển vi huỳnh quang

1. Tìm hiểu về huỳnh quang là gì? Khản năng phát huỳnh quang của mẫu vật

Khi các mẫu vật, sống hoặc không sống, hữu cơ hoặc vô cơ, hấp thụ và sau đó phát lại ánh sáng, quá trình này được mô tả là phát quang .

Nếu sự phát xạ ánh sáng kéo dài trong vài giây sau khi năng lượng kích thích (ánh sáng) ngừng lại, hiện tượng này được gọi là phát quang .

Ngược lại, huỳnh quang mô tả sự phát xạ ánh sáng chỉ tiếp tục trong quá trình hấp thụ ánh sáng kích thích. Khoảng thời gian giữa sự hấp thụ ánh sáng kích thích và sự phát xạ ánh sáng tái phát trong huỳnh quang có thời gian cực kỳ ngắn, thường dưới một phần triệu giây.

Hình 1, một photon của bức xạ cực tím (màu tím) va chạm với một electron trong một nguyên tử đơn giản, kích thích và nâng electron lên mức năng lượng cao hơn. Sau đó, electron bị kích thích thư giãn ở mức thấp hơn và phát ra ánh sáng dưới dạng một photon năng lượng thấp hơn (màu đỏ) trong vùng ánh sáng khả kiến.

Ánh sáng huỳnh quang có bước sóng dài hơn ánh sáng kích thích

Hình 2 là sơ đồ biểu diễn vùng ánh sáng khả kiến ​​của bức xạ điện từ, bao phủ phạm vi bước sóng từ khoảng 400 đến 700 nanomet. Bao quanh vùng khả kiến ​​là ánh sáng cực tím năng lượng cao hơn và ánh sáng hồng ngoại năng lượng thấp hơn.

Hình 3 trình bày biểu diễn đồ họa về các hiện tượng xảy ra khi quan sát mẫu huỳnh quang bằng kính hiển vi huỳnh quang. Ánh sáng cực tím ( UV ) có bước sóng hoặc tập hợp các bước sóng cụ thể được tạo ra bằng cách truyền ánh sáng từ nguồn phát cực tím qua bộ lọc kích thích. Ánh sáng cực tím được lọc sẽ chiếu sáng mẫu vật, trong trường hợp này là tinh thể fluorit, sau đó tinh thể này sẽ phát ra ánh sáng huỳnh quang khi được chiếu sáng bởi ánh sáng cực tím. Ánh sáng khả kiến ​​phát ra từ mẫu vật, màu đỏ trong Hình 3, sau đó được lọc qua bộ lọc chắn không cho ánh sáng cực tím phản xạ đi qua.

2. Nguyên lý hoạt động của kính hiển vi huỳnh quang

Kính hiển vi huỳnh quang là một phương pháp tuyệt vời để nghiên cứu vật liệu có thể phát huỳnh quang, ở dạng tự nhiên (gọi là huỳnh quang sơ cấp hoặc tự phát huỳnh quang ) hoặc khi được xử lý bằng hóa chất có khả năng phát huỳnh quang (gọi là huỳnh quang thứ cấp )

Nhiệm vụ cơ bản của kính hiển vi huỳnh quang là cho phép ánh sáng kích thích chiếu vào mẫu vật và sau đó tách ánh sáng huỳnh quang phát ra yếu hơn nhiều khỏi ánh sáng kích thích sáng hơn. Do đó, chỉ có ánh sáng phát ra từ mẫu vật mới đến được mắt hoặc camera.

  Hình ảnh minh họa kính hiển vi huỳnh quang

Kính hiển vi huỳnh quang là thiết bị tạo ảnh từ hiệu ứng phát huỳnh quang của vật mẫu. Nó bao gồm một nguồn sáng mạnh phát ánh sáng trắng đóng vai trò một nguồn kích thích huỳnh quang. Ánh sáng từ nguồn sáng trắng sau khi qua hệ quang học trực chuẩn (để tạo chùm tia song song) sẽ đi qua một bộ lọc sắc (excitation filter) cho phép lọc ra một chùm tia đơn sắc được sử dụng làm ánh sáng kích thích huỳnh quang. Bộ lọc sắc này có thể thay đổi để tùy chọn màu sắc của ánh sáng kích thích.

Ánh sáng kích tiếp đó sẽ đi tới một gương lưỡng hướng sắc (dichroic mirror) và phản xạ trên gương này để đi qua hệ vật kính nhằm tạo ra chùm tia hội tụ kích thích vật mẫu. Ánh sáng kích thích mẫu vật và tạo ra sự phát huỳnh quang từ mẫu vật - bước sóng huỳnh quang sẽ dài hơn bước sóng ánh sáng kích thích.

Ánh sáng phát huỳnh quang từ mẫu sẽ được thu lại qua vật kính và đi tới gương lưỡng hướng sắc. Gương này là một thiết bị quang học có tính lọc lựa, nó cho phép ánh sáng với một số bước sóng nhất định truyền qua, trong khi các bước sóng khác sẽ bị phản xạ. Trong trường hợp này, ánh sáng bước sóng ngắn kích thích sẽ bị phản xạ, còn ánh sáng phát huỳnh quang từ vật mẫu (với bước sóng dài hơn) sẽ truyền qua gương này để tạo thành ảnh qua thị kính hay trên camera ghi ảnh.

Ảnh tạo ra sẽ là ảnh từ các ánh sáng huỳnh quang, vì thế sẽ có màu sắc ở dải bước sóng dài hơn so với ánh sáng kích thích ban đầu.

Các kỹ thuật của kính hiển vi huỳnh quang có thể được áp dụng cho vật liệu hữu cơ, vật liệu sống (sinh học) trước đây, hoặc vật liệu sống (với việc sử dụng chất huỳnh quang trong ống nghiệm hoặc trong cơ thể sống ) hoặc vật liệu vô cơ (đặc biệt là trong việc nghiên cứu các chất gây ô nhiễm trên các tấm bán dẫn).

Ngoài ra còn có một số lượng lớn các nghiên cứu sử dụng đầu dò huỳnh quang để theo dõi nồng độ ion sinh lý thay đổi nhanh chóng, chẳng hạn như canxi và magiê, và giá trị pH trong các tế bào sống.

3. Các bộ phận của kính hiển vi huỳnh quang thông thường

• Nguồn sáng ở chế độ trường sáng (bóng LED hoặc halogen)
• Nguồn sáng kích thích huỳnh quang dùng trong chế độ huỳnh quang (đèn hơi thủy ngân, đèn hồ quang xenon…)
• Bộ lọc kích thích dùng để lọc có chọn lọc các bước sóng ngắn kích thích, nằm trong dải bước sóng đã thiết kế sẵn (thường nằm trên đường dẫn quang sau bóng đèn thủy ngân)
• Bộ lọc phản xạ bộ lọc này có tác dụng lọc có chọn lọc các ánh sáng có bước sóng ngắn chỉ cho ánh sáng có bước sóng dài truyền qua (nằm giữa vật kính và thị kính,)
• Tụ quang để hội tụ chùm sáng
• Màn chắn sáng, khẩu độ chắn sáng
• Gương lưỡng hướng sắc (hoặc bộ phân chia chùm tia lưỡng sắc)
• Bàn đỡ mẫu vật và kẹp mẫu
• Núm chỉnh bàn di mẫu vật trục XY
• Mâm vật kính có khả năng xoay vòng để lựa chọn vật kính có độ phóng đại thích hợp khi quan sát.
• Vật kính : là một ống hình trụ có một hay nhiều thấu kính, để thu ánh sáng đi xuyên qua mẫu. Vật kính có các độ phóng đại điển hình như 4x, 5x, 10x, 20x, 40x, 50x, 60x và 100x có thể được lắp đặt trên cùng một mâm vật kính. (các vật kính của kính huỳnh quang thường có khẩu độ cao hơn vật kính thông thường có cùng độ phóng đại)
• Thị kính : là một ống hình trụ có hai hay nhiều thấu kính, giúp hội tụ hình ảnh của mẫu vật lên võng mạc của mắt. Độ phóng đại điển hình của thị kính là 10x.

• Núm chỉnh chỉnh thô và chỉnh tinh
• Đầu quan sát có cổng kết nối với camera
• Tấm chắn tia UV bảo vệ mắt

                                       Sơ đồ mặt cắt của kính hiển vi huỳnh quang Epi

Cấu hình kính hiển vi huỳnh quang sớm nhất có một chuỗi quang học trường sáng hoặc trường tối (ánh sáng truyền qua) cổ điển tập trung ánh sáng kích thích đi qua bộ lọc vào mặt phẳng mẫu vật.

Phát xạ huỳnh quang được thu thập bởi vật kính, cùng với một lượng đáng kể ánh sáng kích thích và chiếu qua bộ lọc thứ hai vào màng chắn thị kính để tạo thành hình ảnh trung gian.

Vì cường độ ánh sáng kích thích thường lớn hơn nhiều bậc độ lớn so với phát xạ huỳnh quang, nên chế độ xem mẫu vật trong các kính hiển vi ánh sáng truyền qua ban đầu này thường có độ tương phản rất thấp và chồng lên nền tràn ngập ánh sáng kích thích phân tán.

Sử dụng tụ quang trường tối ngâm dầu có khẩu độ số cao để chiếu sáng mẫu vật ở góc phương vị rất xiên giúp loại bỏ hầu hết nhiễu nền, nhưng không cung cấp đủ ánh sáng cho bất kỳ vật kính nào ngoại trừ các vật kính có khẩu độ số thấp nhất. Hình ảnh thu được có độ phân giải kém và độ sáng rất thấp.

Ngày nay kính hiển vi huỳnh quang ánh sáng phản xạ là phương pháp hiện đang được lựa chọn áp đảo cho các nghiên cứu trường rộng với các nguồn sáng không đồng nhất, cũng như các nghiên cứu được thực hiện bằng các thiết bị quét laser confocal và đa quang. Chế độ kính hiển vi huỳnh quang phổ biến này còn được gọi là huỳnh quang ánh sáng tới, huỳnh quang episcopic hoặc đơn giản là huỳnh quang epi . Một kính hiển vi huỳnh quang ánh sáng phản xạ hiện đại điển hình, cũng được trang bị để quan sát ánh sáng truyền qua ở nhiều chế độ tăng cường độ tương phản.