Phương pháp kết hợp huỳnh quang với độ tương phản pha

Để giảm thiểu tác động của hiện tượng tẩy trắng do ánh sáng, kính hiển vi huỳnh quang có thể được kết hợp với các kỹ thuật khác không phá hủy chất huỳnh quang, chẳng hạn như độ tương phản giao thoa khác biệt (DIC), độ tương phản điều chế Hoffman (HMC), chiếu sáng trường tối truyền qua và độ tương phản pha.

Ý tưởng là xác định vị trí một khu vực quan tâm cụ thể trong mẫu vật bằng kỹ thuật tăng cường độ tương phản không phá hủy sau đó, không di chuyển mẫu vật, chuyển kính hiển vi sang chế độ huỳnh quang. Kết quả của một thí nghiệm điển hình thuộc loại này được minh họa trong Hình 1.

Hình 1(a) minh họa nguyên bào sợi 3T3 trong nuôi cấy mô đơn lớp được chụp bằng quang học tương phản pha. Dòng tế bào được thiết lập từ dòng tế bào phôi chuột Thụy Sĩ của Viện Y tế Quốc gia, có khả năng ức chế tiếp xúc cao và hữu ích cho các nghiên cứu liên quan đến sự hình thành virus sarcoma và sự lan truyền của virus bệnh bạch cầu. Ảnh chụp vi mô trong Hình 1(b) cho thấy cùng một trường nhìn, nhưng lần này được chụp bằng cách sử dụng đèn huỳnh quang với các tế bào nhuộm bằng thuốc nhuộm huỳnh quang 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), một loại thuốc nhuộm đặc hiệu cho axit nucleic có mức phát xạ cực đại là 461 nanomet, được sử dụng để nhuộm chọn lọc nhân và chromatin. Hình 1(c) minh họa hai kỹ thuật được sử dụng kết hợp để tạo ra một ảnh chụp hiển vi đẹp về nhân tế bào 3T3 nhuộm huỳnh quang chồng lên hình ảnh tương phản pha của màng tế bào nguyên bào sợi và các bào quan bên trong.

Hình ảnh này được ghi lại bằng vật kính fluorit chuyên dụng được thiết kế với các vòng pha để cho phép quan sát đồng thời cả huỳnh quang và tương phản pha với cùng một vật kính.

Cấu hình kính hiển vi thường được sử dụng để chụp ảnh đồng thời các mẫu vật bằng cả độ tương phản pha và chiếu sáng huỳnh quang được minh họa trong Hình 2. Độ tương phản pha được thực hiện bằng cách sử dụng ánh sáng truyền qua đèn halogen vonfram được đặt trong một hộp đèn gắn vào đế kính hiển vi. Ánh sáng đi qua màng chắn trường được phản xạ bởi một gương vào tụ điện phụ và qua một vành pha có kích thước phù hợp.

Ánh sáng nhiễu xạ bởi mẫu vật trước tiên được truyền qua một tấm pha được đặt ở mặt phẳng tiêu cự phía sau của vật kính trước khi giao thoa tại mặt phẳng ảnh trung gian với ánh sáng đi qua mẫu vật mà không bị nhiễu xạ. Đồng thời, ánh sáng cực tím phát ra từ đèn đốt thủy ngân được truyền qua bộ lọc kích thích, sau đó được phản xạ bởi gương lưỡng sắc lên mẫu vật từ phía trên. Huỳnh quang thứ cấp phát ra từ chất tạo màu gắn vào mẫu vật nhuộm được vật kính thu lại và truyền qua bộ lọc chắn và vào thị kính và/hoặc ống quang. Cấu hình này có thể được sử dụng để chụp ảnh mẫu vật bằng các kỹ thuật (huỳnh quang và độ tương phản pha) riêng lẻ hoặc kết hợp.