Nguồn sáng cho kính hiển vi huỳnh quang, so sánh các loại bóng đèn dùng trong huỳnh quang

Trong hầu hết các ứng dụng kính hiển vi huỳnh quang, số lượng photon đến mắt hoặc các máy dò khác, chẳng hạn như máy ảnh hoặc bộ nhân quang, thường rất thấp. Điều này là do năng suất lượng tử của hầu hết các chất huỳnh quang đều thấp (năng suất lượng tử là tỷ lệ giữa số lượng lượng tử do mẫu vật phát ra so với số lượng lượng tử được hấp thụ). Để tạo ra đủ cường độ ánh sáng kích thích để cung cấp khả năng phát xạ có khả năng phát hiện, cần có các nguồn sáng mạnh. Trong khi đèn LED đang cải thiện khả năng về góc nhìn công suất và quang phổ và đang trở nên phổ biến trên thị trường, thì đèn hồ quang (đèn đốt) (Hình 1) vẫn chiếm đa số. Những loại đèn này chứa đầy khí áp suất cao và cần được xử lý thận trọng.

Đèn phổ biến nhất là đèn đốt thủy ngân, có công suất từ ​​50 watt đến 200 watt và đèn đốt xenon có công suất từ ​​75 watt đến 150 watt. Đèn đốt thủy ngân trong Hình 1 bao gồm hai điện cực được bịt kín dưới áp suất cao trong một lớp vỏ thủy tinh thạch anh cũng chứa thủy ngân.

Các nguồn sáng này thường được cấp nguồn bằng nguồn điện DC cung cấp đủ điện khởi động để đốt cháy đầu đốt (bằng cách ion hóa hơi khí) và duy trì cháy với mức nhấp nháy tối thiểu. Nguồn điện phải có bộ hẹn giờ để bạn có thể theo dõi số giờ đầu đốt đã được sử dụng. Đèn hồ quang mất hiệu suất và có nhiều khả năng vỡ hơn nếu sử dụng quá tuổi thọ định mức. Đầu đốt thủy ngân không cung cấp cường độ đồng đều trên toàn phổ từ tia cực tím đến tia hồng ngoại (Xem Hình 2 để biết phổ phát xạ của đầu đốt thủy ngân). Phần lớn cường độ của đầu đốt thủy ngân được sử dụng ở tia cực tím gần, với các đỉnh cường độ ở 313, 334, 365, 406, 435, 546 và 578 nanomet. Ở các bước sóng ánh sáng khả kiến ​​khác, cường độ ổn định nhưng không sáng bằng, nhưng vẫn có thể sử dụng để kích thích màu xanh lam. Cũng cần hiểu rằng công suất không phải là yếu tố duy nhất cần xem xét để xác định độ sáng.

Một tiêu chí quan trọng khác là kích thước của cung; độ sáng trên một đơn vị diện tích của cung bao quanh trong khẩu độ sau của vật kính là thước đo tốt hơn về độ sáng hữu ích của đầu đốt. Sử dụng tiêu chí này, bạn sẽ lưu ý rằng trong ba đầu đốt thủy ngân được liệt kê trong Bảng 1, đầu đốt 100 watt (các yếu tố khác đều như nhau) là sáng nhất trong ba đầu đốt. Một yếu tố quan trọng khác khi lựa chọn đầu đốt là các đỉnh cường độ quang phổ của bước sóng đầu đốt có khớp với các yêu cầu kích thích đối với các chất huỳnh quang nhuộm mẫu vật hay không. Bất cứ khi nào đánh giá hệ thống chiếu sáng, cần phải xem xét toàn bộ hệ thống bao gồm các thấu kính thu thập và việc sử dụng các màng chắn khẩu độ và trường để đảm bảo độ chiếu sáng Köhler.

Đèn xenon có cường độ đều hơn nhiều trên toàn bộ quang phổ khả kiến ​​so với đèn thủy ngân (Xem Hình 3); chúng không có các đỉnh cường độ quang phổ rất cao đặc trưng của đèn thủy ngân. Đèn xenon thiếu tia cực tím; chúng tiêu tốn phần lớn cường độ của chúng vào vùng đỏ trong, do đó việc sử dụng các loại đèn như vậy đòi hỏi phải cẩn thận trong việc kiểm soát nhiệt. Đèn xenon khe hở ngắn thường được ưa chuộng hơn vì kích thước của hồ quang sao cho ánh sáng của nó có thể dễ dàng đi vào bên trong khẩu độ phía sau của vật kính, do đó tránh lãng phí cường độ ánh sáng.

THẬN TRỌNG!
Đèn hồ quang thủy ngân và Xenon cần phải thận trọng trong quá trình vận hành vì nguy cơ nổ do áp suất khí bên trong rất cao và nhiệt độ cực cao sinh ra trong quá trình sử dụng. Không bao giờ đốt đèn bên ngoài vỏ đèn hoặc quan sát trực tiếp đèn khi đèn đang cháy (điều này có thể gây tổn thương mắt nghiêm trọng). Không được cầm đèn thủy ngân hoặc đèn xenon bằng ngón tay trần để tránh vô tình khắc lớp vỏ thạch anh. Chỉ thay bóng đèn sau khi đèn đã đủ thời gian để nguội. Bảo quản đèn trong thùng vận chuyển để tránh tai nạn.

Luôn tuân thủ các quy trình an toàn được liệt kê ở trên khi lắp đặt hoặc thay đổi đèn hồ quang thủy ngân hoặc xenon.

Đầu đốt thủy ngân có tuổi thọ 200 giờ; đầu đốt xenon có tuổi thọ lên đến hàng trăm giờ. Việc bật-tắt thường xuyên làm giảm tuổi thọ của đèn. Khi đầu đốt đạt đến tuổi thọ định mức, phát xạ quang phổ có thể thay đổi và lớp vỏ thạch anh yếu đi.

Đôi khi, bóng đèn halogen vonfram được sử dụng, đặc biệt là để kích thích màu xanh lam hoặc xanh lục với các mẫu vật phát sáng rực rỡ. Đầu ra của chúng tương đối đều trên toàn bộ quang phổ khả kiến ​​(Hình 4); chúng thiếu tia cực tím gần và cũng có tỷ lệ cường độ tương đối cao trong tia hồng ngoại. Những loại đèn này không yêu cầu nguồn điện đắt tiền để đánh lửa nhưng được cấp điện bằng máy biến áp điện áp thấp; bóng đèn có thể sử dụng trong ba mươi đến năm mươi giờ khi sử dụng ở điện áp định mức tối đa.

Trong những năm gần đây, việc sử dụng laser ngày càng tăng , đặc biệt là laser argon-ion có khả năng phát xạ mạnh ở 488 và 514 nanomet. Các nguồn laser, mặc dù có giá thành cao, đã trở nên đặc biệt hữu ích trong kính hiển vi quét laser confocal. Có một số loại laser khác nhau, mỗi loại cung cấp một phổ phát xạ riêng. Hình 5 minh họa phổ phát xạ của hai loại laser được sử dụng phổ biến nhất trong kính hiển vi huỳnh quang.

Kỹ thuật này, với nhiều biến thể thiết bị, đã chứng minh là một công cụ mạnh mẽ trong việc tạo ra hình ảnh huỳnh quang rất sắc nét bằng cách khéo léo kiểm soát ánh sáng ngoài tiêu điểm. Điều này được thực hiện thông qua việc quét và chụp ảnh các khu vực cực nhỏ, nông liên tiếp. Các phần quang học của mẫu vật được lưu trữ trong máy tính và tái tạo thành toàn bộ hình ảnh sau đó có thể hiển thị trên màn hình video hoặc in bằng máy in video. cấp màn hình căn giữa tùy chọn để tạo điều kiện căn giữa hình ảnh của vòng cung đèn với khẩu độ phía sau của vật kính. Phụ kiện này có ren tiêu chuẩn của Hiệp hội Kính hiển vi Hoàng gia (RMS) ở đầu trên và có thể vặn vào ống ngắm. Nó được đặt ở đó và xoay vào đường đi của ánh sáng. Mặt dưới của phụ kiện có kính mờ màu cam với đường ngắm khắc.

Ánh sáng chiếu xuống từ gương hai màu chiếu vào bộ phản xạ tích hợp của màn chắn trung tâm và được phản xạ lên đường ngắm, như minh họa trong Hình 6. Khi bạn thao tác núm tụ điện đèn và các vít định tâm trên đui đèn, bạn có thể di chuyển hình ảnh sao cho nó được định tâm đến đường ngắm (Hình 7(a)). Kích thước của hình ảnh cung tròn có thể được làm to hơn hoặc nhỏ hơn bằng cách thao tác cần gạt tụ điện đèn. Khi bạn hoàn tất với phụ kiện định tâm, nó có thể được thay thế bằng một vật kính thông thường. Nếu hộp đèn có gương, vị trí gương phải được điều chỉnh sao cho hình ảnh cung tròn trong gương được định vị song song và liền kề với chính hình ảnh cung tròn như minh họa trong Hình 7(b).

Nếu bạn không có màn hình căn giữa, bạn có thể sử dụng quy trình thay thế sau. Lấy nét mẫu vật bằng vật kính 10x. Sau đó xoay phần mũi sao cho một lỗ trống trên phần mũi nằm trong đường dẫn quang học của kính hiển vi. Đặt một tấm bìa trắng lên bệ mẫu (thay cho mẫu vật) và bạn sẽ thấy hình ảnh của vòng cung chiếu lên tấm bìa. Bằng cách điều chỉnh núm tụ điện đèn và các vít căn giữa đầu đốt trên giá đèn, bạn có thể căn giữa hình ảnh của vòng cung với trục quang học của kính hiển vi.