Phương pháp kết hợp huỳnh quang với độ tương phản giao thoa vi sai (DIC)

Phương pháp kết hợp huỳnh quang với độ tương phản giao thoa vi sai (DIC)

Để giảm thiểu tác động của hiện tượng tẩy trắng do ánh sáng, kính hiển vi huỳnh quang có thể được kết hợp với các kỹ thuật khác không phá hủy chất huỳnh quang, chẳng hạn như độ tương phản giao thoa khác biệt (DIC), độ tương phản điều chế Hoffman (HMC), chiếu sáng trường tối truyền qua và độ tương phản pha.

Ý tưởng là xác định vị trí một khu vực quan tâm cụ thể trong mẫu vật bằng kỹ thuật tăng cường độ tương phản không phá hủy sau đó, không di chuyển mẫu vật, chuyển kính hiển vi sang chế độ huỳnh quang. Kết quả của một thí nghiệm điển hình thuộc loại này được minh họa trong Hình 1.

Hình 1(a) minh họa một lát mỏng mô hạch thị giác võng mạc chuột được chụp bằng độ tương phản giao thoa vi sai. Ảnh chụp vi mô trong Hình 1(b) cho thấy cùng một trường nhìn, nhưng lần này được chụp bằng cách sử dụng đèn huỳnh quang với các tế bào nhuộm màu xanh lam huỳnh quang nhanh, một loại muối diazonium nhuộm màu đặc hiệu các phospholipid trong bao myelin. Hình 1(c) minh họa hai kỹ thuật được sử dụng kết hợp để tạo ra một ảnh chụp vi mô đẹp mắt về mô lipid hạch thị giác nhuộm huỳnh quang chồng lên ảnh tương phản giao thoa vi sai của võng mạc. Hình ảnh này được ghi lại bằng vật kính fluorit chuyên dụng được thiết kế để cho phép quan sát đồng thời cả độ tương phản huỳnh quang và độ tương phản giao thoa vi sai với cùng một vật kính.

Cấu hình kính hiển vi thường được sử dụng để chụp ảnh đồng thời các mẫu vật bằng cả độ tương phản giao thoa vi sai (DIC) và chiếu sáng huỳnh quang được minh họa trong Hình 2. DIC được tiến hành bằng cách sử dụng ánh sáng truyền qua đèn halogen vonfram được đặt trong một hộp đèn gắn vào đế kính hiển vi. Ánh sáng đi qua màng chắn trường được phản xạ bởi một gương vào tụ điện phụ và qua lăng kính Wollaston nằm ở mặt phẳng tiêu cự phía trước của tụ điện.

Ánh sáng nhiễu xạ bởi mẫu vật trước tiên được truyền qua lăng kính Wollaston thứ hai được đặt gần mặt phẳng tiêu cự phía sau của vật kính trước khi giao thoa tại mặt phẳng ảnh trung gian với ánh sáng đi qua mẫu vật mà không bị nhiễu xạ. Đồng thời, ánh sáng cực tím phát ra từ đèn đốt thủy ngân được truyền qua bộ lọc kích thích, sau đó được phản xạ bởi gương lưỡng sắc lên mẫu vật từ phía trên. Huỳnh quang thứ cấp phát ra từ chất tạo màu gắn vào mẫu vật nhuộm được vật kính thu lại và truyền qua bộ lọc chắn và vào thị kính và/hoặc ống quang. Cấu hình này có thể được sử dụng để chụp ảnh mẫu vật bằng các kỹ thuật (huỳnh quang và độ tương phản giao thoa vi sai) riêng lẻ hoặc kết hợp.