Kính hiển vi trường tối là gì? Cấu tạo kính hiển vi trường tối

Kính hiển vi trường tối là một loại kính hiển vi quang học soi thẳng thay đổi phương pháp quan sát để nâng cao độ tương phản của mẫu vật, thường đối với vi khuẩn, các mẫu vật không màu hoặc có độ tương phản tương đương với nền…. và khó có thể hoặc không thể quan sát bằng phương pháp trường sáng thông thường.

Sau đây chúng ta cùng tim hiểu về chiếu sáng trường tối là gì?

Tất cả chúng ta đều khá quen thuộc với sự xuất hiện và khả năng nhìn thấy các ngôi sao vào một đêm tối, mặc dù chúng cách Trái Đất rất xa. Các ngôi sao có thể dễ dàng được quan sát vào ban đêm chủ yếu là do sự tương phản rõ rệt giữa ánh sáng yếu ớt của chúng và bầu trời đen.

Tuy nhiên, các ngôi sao vẫn sáng cả ngày lẫn đêm, nhưng chúng vô hình vào ban ngày vì độ sáng chói chang của mặt trời "làm mờ" ánh sáng yếu ớt từ các ngôi sao, khiến chúng trở nên vô hình. Trong nhật thực toàn phần, mặt trăng di chuyển giữa Trái Đất và mặt trời, chặn ánh sáng của mặt trời và các ngôi sao giờ đây có thể được nhìn thấy mặc dù là ban ngày. Tóm lại, khả năng nhìn thấy ánh sáng yếu ớt của các ngôi sao được tăng cường rất nhiều trên nền tối.

Nguyên lý này được áp dụng trong kính hiển vi trường tối (còn gọi là nền tối ), một phương pháp đơn giản và phổ biến để làm cho các mẫu vật trong suốt không nhuộm màu trở nên rõ ràng.

Các vật thể như vậy thường có chiết suất rất gần với giá trị của môi trường xung quanh và khó chụp ảnh bằng kính hiển vi trường sáng thông thường. Ví dụ, nhiều sinh vật thủy sinh nhỏ có chiết suất từ ​​1,2 đến 1,4, dẫn đến sự khác biệt quang học không đáng kể so với môi trường nước xung quanh. Đây là những ứng cử viên lý tưởng cho chiếu sáng trường tối.

Nguyên lý tạo ảnh trường tối ở kính hiển vi quang học ánh sáng ở chế độ truyền qua và phản xạ

Chiếu sáng trường tối đòi hỏi phải chặn ánh sáng trung tâm, thường đi qua và xung quanh (bao quanh) mẫu vật, chỉ cho phép các tia xiên từ mọi phương vị "tấn công" mẫu vật được gắn trên phiến kính hiển vi.

Thấu kính trên cùng của tụ quang trường tối Abbe đơn giản có dạng lõm hình cầu, cho phép các tia sáng thoát ra từ bề mặt ở mọi phương vị để tạo thành một hình nón rỗng ngược có đỉnh nằm ở tâm mặt phẳng mẫu vật. Nếu không có mẫu vật nào và khẩu độ số của tụ quang lớn hơn khẩu độ số của vật kính, các tia xiên sẽ giao nhau và tất cả các tia như vậy sẽ không đi vào vật kính do độ xiên của chúng. Trường nhìn sẽ tối.

                                              

Cặp tụ quang trường tối/vật kính minh họa trong Hình 1 là một sự sắp xếp khẩu độ số cao đại diện cho kính hiển vi trường tối trong cấu hình tinh vi nhất của nó, sẽ được thảo luận chi tiết bên dưới. Vật kính chứa một màng chắn mống mắt bên trong có tác dụng giảm khẩu độ số của vật kính xuống một giá trị thấp hơn giá trị của hình nón ánh sáng rỗng ngược phát ra bởi tụ quang. Tụ quang cardioid là một thiết kế trường tối phản xạ dựa vào các gương bên trong để chiếu một hình nón ánh sáng không có quang sai lên mặt phẳng mẫu vật.

Khi mẫu vật được đặt trên phiến kính, đặc biệt là mẫu vật không nhuộm màu, không hấp thụ ánh sáng, các tia xiên sẽ cắt qua mẫu vật và bị nhiễu xạ, phản xạ và/hoặc khúc xạ bởi các điểm gián đoạn quang học (như màng tế bào, nhân và các bào quan bên trong) cho phép các tia yếu này đi vào vật kính. Sau đó, mẫu vật có thể được nhìn thấy sáng trên nền đen. Về mặt quang học Fourier, chiếu sáng trường tối loại bỏ bậc không (ánh sáng không tán xạ) khỏi mẫu nhiễu xạ được hình thành ở mặt phẳng tiêu cự phía sau của vật kính. Điều này tạo ra một hình ảnh được hình thành hoàn toàn từ các cường độ nhiễu xạ bậc cao hơn bị mẫu vật tán xạ.

Các ảnh chụp vi mô trong Hình 2 minh họa tác động của chiếu sáng trường tối và trường sáng trên bộ xương silica từ một động vật nguyên sinh biển nhỏ (radiolarian) trong một mẫu vật gắn kết toàn bộ. Trong trường sáng thông thường, các đặc điểm bộ xương của radiolarian không được xác định rõ ràng và có xu hướng bị xóa trong các ảnh chụp vi mô được ghi lại bằng phim truyền thống hoặc chụp kỹ thuật số.

Ảnh chụp vi mô trong Hình 2(a) được chụp trong điều kiện chiếu sáng trường sáng với màng chắn khẩu độ tụ quang đóng đến một điểm mà các hiện tượng nhiễu xạ che khuất một số chi tiết của mẫu. Điều này làm tăng độ tương phản của mẫu vật nhưng lại làm méo hình ảnh.

Dưới điều kiện chiếu sáng trường tối (Hình 2(b)), có nhiều chi tiết hơn, đặc biệt là ở phần trên của sinh vật và hình ảnh có được hình dạng ba chiều rõ ràng. Khi sử dụng bộ lọc màu đỏ kết hợp với điểm dừng trường tối (Hình 2(c)), radiolarian có vẻ ngoài đầy màu sắc đẹp mắt hơn, mặc dù không tạo ra thêm chi tiết nào và thậm chí chất lượng hình ảnh còn giảm đi một chút.

Các mẫu vật có bề mặt phản chiếu nhẵn tạo ra hình ảnh một phần là do sự phản xạ ánh sáng vào vật kính. Trong những trường hợp chiết suất khác với môi trường xung quanh hoặc có sự thay đổi chiết suất (như ở rìa màng), ánh sáng bị khúc xạ bởi mẫu vật. Cả hai trường hợp phản xạ và khúc xạ đều tạo ra những thay đổi góc tương đối nhỏ theo hướng ánh sáng, cho phép một số ánh sáng đi vào vật kính. Ngược lại, một số ánh sáng chiếu vào mẫu vật cũng bị nhiễu xạ , tạo ra một cung sáng 180 độ đi qua toàn bộ phạm vi khẩu độ số của vật kính. Độ phân giải của vật kính giống nhau trong điều kiện chiếu sáng trường tối như được quan sát thấy trong điều kiện trường sáng, nhưng đặc tính quang học của hình ảnh không được tái tạo trung thực (trừ khi sử dụng màng chắn mống mắt được thiết kế đặc biệt để hạ thấp khẩu độ số hiệu dụng với các vật kính ngâm dầu có độ phóng đại cao được thiết kế riêng cho kính hiển vi trường tối).

Như trong ví dụ về ánh sáng sao được mô tả ở trên, khả năng hiển thị được tăng cường đáng kể nhờ độ tương phản giữa mẫu vật sáng chói và vùng tối xung quanh. Như đã thảo luận ở trên, điều đã xảy ra trong chiếu sáng trường tối là tất cả các tia sáng thông thường không bị lệch bậc không đã bị chặn bởi điểm dừng mờ đục. Các tia xiên, hiện bị mẫu vật nhiễu xạ và tạo ra các bậc nhiễu xạ bậc nhất, bậc hai và bậc cao hơn ở mặt phẳng tiêu cự phía sau của vật kính, tiến vào mặt phẳng ảnh, tại đó chúng giao thoa với nhau để tạo ra ảnh của mẫu vật.

Các ứng cử viên lý tưởng cho chiếu sáng trường tối bao gồm các sinh vật thủy sinh nhỏ, tảo cát, côn trùng nhỏ, xương, sợi, tóc, vi khuẩn không nhuộm, nấm men, tế bào trong nuôi cấy mô và động vật nguyên sinh. Các mẫu vật phi sinh học bao gồm tinh thể khoáng chất và hóa học, các hạt keo, mẫu vật đếm bụi và các phần mỏng của polyme và gốm chứa các tạp chất nhỏ, sự khác biệt về độ xốp hoặc độ dốc chiết suất. Cần cẩn thận khi chuẩn bị mẫu vật cho kính hiển vi trường tối vì các đặc điểm nằm trên và dưới mặt phẳng tiêu điểm cũng có thể phân tán ánh sáng và góp phần làm giảm chất lượng hình ảnh. Độ dày của mẫu vật và độ dày của phiến kính hiển vi cũng rất quan trọng và nói chung, mẫu vật mỏng là mong muốn để loại bỏ khả năng xuất hiện các hiện tượng nhiễu xạ có thể ảnh hưởng đến quá trình hình thành hình ảnh.

Các Tụ Quang tầng phụ minh họa trong Hình 3 chứng minh tác động của một điểm dừng mờ đục trên đường dẫn ánh sáng qua một Tụ Quang khúc xạ đơn giản. Bên trái (Hình 3(a)), là một Tụ Quang trường sáng Abbe điển hình được định vị với màng chắn khẩu độ mở để tối đa hóa khẩu độ số của hình nón sáng. Ánh sáng từ nguồn đi qua màng chắn khẩu độ và sau đó được khúc xạ qua một số thành phần thấu kính để tạo thành một hình nón sáng ngược với khẩu độ số xấp xỉ 1,20. Khi một điểm dừng ánh sáng kiểu nhện mờ đục (Hình 3(b)) được chèn bên dưới màng chắn khẩu độ mở hoàn toàn, các tia sáng ở trung tâm bị chặn lại, chỉ cho phép các tia sáng ngoại vi đi qua thấu kính để tạo thành một hình nón sáng rỗng xiên ngược mà không thay đổi khẩu độ số (1,20). Hình nón sáng rỗng chiếu sáng được hình thành bằng cách khúc xạ ánh sáng tại chu vi của các thành phần thấu kính, nơi hiệu chỉnh quang học thường kém nhất. Mặc dù vậy, Tụ Quang này sẽ hoạt động đầy đủ khi sử dụng các vật kính có độ phóng đại thấp và tạo ra kết quả rất tốt cho công việc trường tối định tính. Đối với kính hiển vi định lượng chính xác hơn, cần phải sử dụng tụ quang phẳng (được hiệu chỉnh cho cả quang sai màu và quang sai cầu), hoạt động tốt hơn nhiều bằng cách tạo ra hình ảnh có chi tiết rõ nét hơn và các tính năng đáng tin cậy hơn.

Trong kính hiển vi trường tối, nếu bạn nhìn vào mặt sau của vật kính qua thấu kính Bertrand hoặc kính thiên văn pha, nó sẽ xuất hiện đầy ánh sáng. Ánh sáng nhiễu xạ yếu này được tái tạo thành hình ảnh có thể nhìn thấy tại mặt phẳng của màng chắn thị kính với độ tương phản bị đảo ngược, hình ảnh sáng trên nền đen. Vì kính hiển vi trường tối loại bỏ ánh sáng sáng không bị lệch, nên hình thức chiếu sáng này rất lãng phí ánh sáng và do đó đòi hỏi nguồn sáng cường độ cao. Các phiến kính hiển vi phải có độ dày thích hợp, khoảng một milimét +/- 0,1 mm. Các phiến kính mẫu và tất cả các bề mặt quang học trên đường đi của ánh sáng phải được vệ sinh sạch sẽ vì mọi hạt bụi bẩn sẽ sáng không thương tiếc.

Có một số thiết bị được sử dụng để tạo ra ánh sáng trường tối. Đơn giản nhất là "spider stop" được đặt ngay dưới thấu kính dưới cùng (ở mặt phẳng tiêu cự phía trước) của tụ quang phụ (Hình 3(b) và 4(a)). Cả màng chắn khẩu độ và trường đều được mở rộng để các tia xiên đi qua. Điểm chặn mờ ở trung tâm (bạn có thể làm một điểm chặn bằng cách gắn một đồng xu lên một đĩa thủy tinh trong suốt) chặn các tia trung tâm. Thiết bị này hoạt động khá tốt, ngay cả với tụ quang Abbe (Hình 3), với vật kính 10x lên đến 40x hoặc cao hơn có khẩu độ số không cao hơn 0,65. Đường kính của điểm chặn mờ phải xấp xỉ 16-18 mm đối với vật kính 10x có khẩu độ số 0,25 đến xấp xỉ 20-24 mm đối với vật kính 20x và 40x có khẩu độ số gần bằng 0,65.

Bộ chặn được minh họa trong Hình 4(a) có kích thước thay đổi từ 8 mm đến 30 mm và cung cấp các chặn mờ trường tối tuyệt vời cho hầu như bất kỳ vật kính khẩu độ số nào (dưới 0,65). Các chặn riêng lẻ có thể được hoán đổi chỉ bằng cách tháo vít ở dưới cùng của nhện hỗ trợ và thay thế chặn bằng một kích thước mới. Kích thước bên ngoài của giá đỡ nhện sẽ thay đổi tùy thuộc vào đường kính lỗ mở vỏ ở dưới cùng của tụ quang.

Bộ phận chặn sáng minh họa trong Hình 4(b) là một thiết bị khéo léo mở rộng và thu hẹp một màng chắn "mống mắt ngược" để tăng hoặc giảm kích thước của bộ phận chặn bằng cách sử dụng một tay điều khiển đòn bẩy. Khi đòn bẩy này được xoay, kích thước của các lá trung tâm thay đổi từ khoảng 10 mm đến 25 mm đường kính, tạo ra một bộ phận chặn lớn hơn cho các vật kính có độ phóng đại cao hơn. Loại màng chắn chặn sáng thay đổi này loại bỏ nhu cầu thay đổi bộ phận chặn sáng mỗi khi lắp một vật kính có công suất cao hơn vào đường dẫn quang học. Nó cũng có thêm một lợi thế là có thể "điều chỉnh" đối với những khác biệt nhỏ trong đường kính bộ phận chặn cần thiết để đạt được hiệu suất tốt nhất khi quan sát mẫu vật. Mặc dù các loại bộ phận chặn sáng màng chắn này hiện rất hiếm, nhưng chúng cung cấp một phương pháp độc đáo để đạt được các hiệu ứng mong muốn cao với ánh sáng trường tối.

Kính hiển vi trường tối ở độ phóng đại cao

Để làm việc chính xác hơn và nền đen hơn, bạn có thể chọn tụ quang được thiết kế đặc biệt cho trường tối, tức là chỉ truyền các tia xiên. Có một số loại: tụ quang trường tối "khô" có không khí giữa đỉnh tụ quang và mặt dưới của phiến kính - và tụ quang trường tối nhúng cần sử dụng một giọt dầu nhúng (một số được thiết kế để sử dụng nước thay thế) để thiết lập tiếp xúc giữa đỉnh tụ quang và mặt dưới của phiến kính mẫu. Tụ quang trường tối nhúng có bề mặt gương bên trong và truyền các tia có độ xiên lớn và không có quang sai màu, tạo ra kết quả tốt nhất và nền đen nhất.

Có lẽ tụ quang trường tối được sử dụng rộng rãi nhất là parabol, bao gồm một mảnh thủy tinh đặc được mài rất chính xác thành hình parabol, như minh họa trong Hình 5(b). Ánh sáng chiếu vào bề mặt phản xạ (giữa thủy tinh và vỏ tụ quang trong Hình 5(b)) của tụ quang parabol sẽ được hội tụ tại tiêu điểm của bộ phản xạ. Hầu hết các tụ quang parabol được cắt để đảm bảo rằng tiêu điểm nằm hơi quá đỉnh của tụ quang để các tia sáng song song sẽ được hội tụ tại vị trí tối đa hóa độ chiếu sáng của mẫu vật. Điểm dừng sáng ở dưới cùng của tụ quang thủy tinh có tác dụng chặn các tia sáng trung tâm chiếu tới mẫu vật. Các tia sáng được tụ quang phản xạ có góc cao hơn góc phản xạ tới hạn và hội tụ tại tiêu điểm chính của tụ quang. Sự kết hợp của một phiến kính, môi trường gắn và dầu nhúng (giữa tụ quang và phiến kính hiển vi) hoàn thiện tính đồng nhất quang học của hình parabol.

Như đã thảo luận ở trên, tụ quang trường tối khô hữu ích cho các vật kính có khẩu độ số dưới 0,75 (Hình 5(a)), trong khi tụ quang nhúng parabol và cardioid (Hình 1 và 5(b)) có thể được sử dụng với các vật kính có khẩu độ số rất cao (lên đến 1,4). Các vật kính có khẩu độ số trên 1,2 sẽ cần giảm một số khẩu độ làm việc của chúng vì khẩu độ số tối đa của chúng có thể vượt quá khẩu độ số của tụ quang, do đó cho phép ánh sáng trực tiếp đi vào vật kính. Vì lý do này, nhiều vật kính có khẩu độ số cao được thiết kế để sử dụng với cả chiếu sáng trường tối cũng như trường sáng được chế tạo với màng chắn mống mắt có thể điều chỉnh tích hợp hoạt động như một điểm dừng khẩu độ.

Việc giảm khẩu độ số này cũng hạn chế khả năng phân giải của vật kính cũng như cường độ ánh sáng trong ảnh. Các vật kính chuyên dụng được thiết kế dành riêng cho công việc trường tối được sản xuất với khẩu độ số tối đa gần với giới hạn dưới của khẩu độ số của tụ quang trường tối. Chúng không có màng chắn mống mắt bên trong, tuy nhiên đường kính ngàm ống kính được điều chỉnh sao cho ít nhất một ống kính bên trong có đường kính tối ưu để hoạt động như một điểm dừng khẩu độ.

Bảng 2 liệt kê một số đặc tính của tụ quang trường tối khẩu độ số cao phản xạ phổ biến nhất. Bảng này nên được sử dụng làm hướng dẫn khi lựa chọn kết hợp tụ quang/vật kính để sử dụng với các ứng dụng trường tối khẩu độ số cao.

Thông số kỹ thuật của Tụ Quang trường tối khẩu độ số cao

Condenser Type	Hollow Cone Numerical Aperture	Objective Maximum Numerical Aperture	Number of Reflecting Surfaces	Optical Corrections
Paraboloid	1.00-1.40	0.85	1 Parabolic	Achromatic
Cardioid	1.20-1.30	1.05	1 Spherical 1 Cardioidal	Achromatic/ Aplanatic
Bicentric	1.20-1.30	1.05	1 Cardioidal 1 Spherical	Aplanatic
Bispheric	1.20-1.30	1.05	2 Spherical	Aplanatic
Cassegrain	1.40-1.50	1.30	1 Aspheric 1 Spherical	Aplanatic
Spot Ring (Bicentric)	1.40-1.50	1.30	2 Spherical	Aplanatic
Nelson Cassegrain	1.30-1.45	1.20	1 Aspheric 1 Spherical	Aplanatic

Các Tụ Quang minh họa trong Hình 5 được thiết kế đặc biệt để tạo ra các hình nón sáng rỗng xiên có khẩu độ số cao để chiếu sáng trường tối. Trong cả hai trường hợp, bề mặt trên của Tụ Quang đều phẳng và vuông góc với trục quang học của kính hiển vi. Tụ Quang bên trái (Hình 5(a)) được thiết kế để sử dụng " khô " mà không có dầu giữa Tụ Quang và mặt dưới của phiến kính hiển vi. Ngược lại, Tụ Quang parabol trong Hình 5(b) được thiết kế để được " bôi dầu " vào đáy của phiến kính hiển vi, ngay bên dưới mẫu vật. Việc không bôi dầu nhúng khi sử dụng Tụ Quang này (hoặc bất kỳ Tụ Quang nào khác được liệt kê trong Bảng 2) sẽ ngăn cản bất kỳ ánh sáng nào chiếu tới mẫu vật. Hình nón rỗng xiên của các tia sáng phát ra từ các Tụ Quang này không thể thoát ra khỏi thấu kính trên cùng nếu không có dầu và sẽ bị phản xạ toàn bộ trở lại Tụ Quang.

Ánh sáng phát ra từ nguồn sáng được phản xạ tại các bề mặt kính gương bên trong các Tụ Quang và thoát ra khỏi đỉnh của Tụ Quang ở các góc nghiêng cao hơn nhiều so với góc tới hạn (khoảng 41 độ) mà tại đó xảy ra phản xạ toàn phần đối với sự truyền ánh sáng từ kính ra không khí. Trong trường hợp Tụ Quang parabol được bôi dầu (Hình 5(b) và các Tụ Quang trong Bảng 2), trong đó chiết suất của kính Tụ Quang, dầu nhúng và tấm kính bằng nhau, ánh sáng phát ra từ Tụ Quang đi qua mẫu vật không bị khúc xạ bởi các giao diện kính-không khí.

Tụ quang khẩu độ số cao phản xạ được liệt kê trong Bảng 2 bao gồm nhiều thiết kế được sử dụng để tạo ra hình nón rỗng xiên của ánh sáng cần thiết cho kính hiển vi trường tối có độ phóng đại cao.

Tụ quang trường tối parabol đã được thảo luận chi tiết ở trên. Một thiết kế rất hữu ích khác là tụ quang cardioid được minh họa trong Hình 1. Thiết kế tụ quang này sử dụng một bán cầu phản chiếu ở trung tâm của tụ quang, vừa đóng vai trò là điểm dừng ánh sáng vừa là bộ phản xạ để hướng ánh sáng vào bề mặt phản xạ thứ hai có hình dạng giống hình cardioid quay, từ đó tụ quang có tên như vậy. Sự kết hợp của các bề mặt phản xạ hình cầu và hình cardioid tạo ra tụ quang không bị coma và cả quang sai cầu và quang sai màu.

Có một số nhược điểm về mặt kỹ thuật khi sử dụng tụ quang có khẩu độ số cao như vậy. Tụ quang cardioid rất nhạy với sự căn chỉnh và phải được định vị cẩn thận để tận dụng hình nón chiếu sáng rất sắc nét, khiến nó trở thành tụ quang trường tối khó sử dụng nhất.

Ngoài ra, tụ quang tạo ra một lượng chói đáng kể, ngay cả từ các hạt bụi nhỏ nhất, và tiêu cự ngắn có thể dẫn đến chiếu sáng kém trên các vật thể có kích thước hoặc độ dày vượt quá vài micron. Khi chọn tiêu bản kính hiển vi cho kính hiển vi trường tối độ phóng đại cao định lượng, hãy đảm bảo chọn tiêu bản làm từ hỗn hợp thủy tinh không có tạp chất huỳnh quang.

Tụ quang phản xạ khẩu độ số cao (Hình 1, 5, 6 và Bảng 2) với chiếu sáng trường tối cung cấp phương pháp lựa chọn để quan sát và chụp ảnh các tập hợp các hạt rất nhỏ hoặc huyền phù dạng keo, ngay cả khi đường kính hạt thấp hơn đáng kể so với giới hạn độ phân giải của vật kính.

Điều này là do ánh sáng bị nhiễu xạ bởi các hạt, đi qua vật kính và trở nên hữu hình dưới dạng đĩa nhiễu xạ sáng. Mỗi hạt có thể nhìn thấy như một đĩa nhiễu xạ nhỏ, với điều kiện khoảng cách ngang giữa các hạt liền kề lớn hơn giới hạn độ phân giải của vật kính. Khi cường độ chiếu sáng tăng lên, độ chênh lệch quang học giữa các hạt nhiễu xạ nhỏ và nền của chúng cũng tăng lên. Đồng thời, ngay cả các hạt nhỏ hơn (chỉ có thể phát hiện được bằng khả năng tán xạ ánh sáng của chúng) hiện cũng nhiễu xạ đủ ánh sáng để trở nên hữu hình và có thể nhìn thấy các hạt lơ lửng ngay cả khi đường kính của chúng nhỏ hơn 40 nanomet, chỉ bằng khoảng một phần năm giới hạn độ phân giải 200 nanomet với vật kính ngâm trong dầu có khẩu độ số cao nhất.

Trong các ứng dụng sinh học, chuyển động của roi vi khuẩn sống có đường kính trung bình khoảng 20 nanomet (quá nhỏ để có thể nhìn thấy bằng trường sáng hoặc đèn DIC) có thể được quan sát và chụp ảnh bằng tụ quang trường tối có khẩu độ số cao.

Cần chú ý cẩn thận đến các chi tiết tra dầu tụ quang khẩu độ số cao vào đáy của phiến kính mẫu. Rất khó để tránh việc đưa các bọt khí nhỏ vào khu vực giữa thấu kính trên cùng của tụ quang và đáy của phiến kính hiển vi, và kỹ thuật này cần được thực hành một cách hoàn hảo.

Các bọt khí sẽ gây ra hiện tượng lóa và méo hình ảnh, dẫn đến mất độ tương phản và làm giảm chất lượng hình ảnh tổng thể. Các vấn đề cũng gặp phải khi sử dụng các phiến kính hiển vi quá dày hoặc quá mỏng. Nhiều tụ quang trường tối chứa phạm vi độ dày của phiến kính có thể sử dụng được ghi trực tiếp trên giá đỡ tụ quang.

Nếu phiến kính quá dày, thường khó để hội tụ tụ quang mà không cần dùng đến dầu nhúng có độ nhớt cao hơn. Mặt khác, các phiến kính quá mỏng có xu hướng phá vỡ liên kết dầu giữa tụ quang và phiến kính. Tốt nhất là nên mua các phiến kính hiển vi chính xác có độ dày phù hợp để tránh bất kỳ vấn đề nào được đề cập ở trên.

Một tình huống độc đáo phát sinh khi các mẫu vật ngâm trong môi trường nước được chụp ảnh bằng tụ quang trường tối có khẩu độ số cao. Trong những điều kiện này, chiết suất của dung dịch nước giới hạn góc nghiêng mà ánh sáng có thể đi qua từ phiến kính hiển vi thủy tinh ( n = 1,515) vào nước ( n = 1,336) bao quanh mẫu vật. Khẩu độ số tối đa của ánh sáng đi qua từ thủy tinh vào nước được đưa ra theo phương trình sau:

NA (chiếu sáng) = 1,555 × sin(i) = 1,336 × sin(90°)

và vì sin(90°) = 1

NA (chiếu sáng) = 1,336

Mặc dù tụ quang trường tối phản xạ được thiết kế để ngâm trong dầu được liệt kê với giới hạn trên của khẩu độ số cao tới 1,50 (xem Bảng 2), ánh sáng góp phần chiếu sáng mẫu vật trong môi trường nước phải có khẩu độ số không lớn hơn 1,336, làm giảm giới hạn trên hiệu quả của chiếu sáng trường tối. Trong trường hợp mẫu vật ngâm trong chất lỏng có chiết suất cao hơn, giới hạn trên hiệu quả của khẩu độ số của chiếu sáng trường tối có thể đạt tới mức tối đa là 1,50, mặc dù điều này khó đạt được trong thực tế.

Tụ quang khẩu độ số cao, dù dùng khô hay dùng dầu, đều phải được căn chính xác vào đường quang của kính hiển vi để đạt hiệu suất tối ưu. Để đạt được điều này, nhiều tụ quang trường tối được chế tạo với một vòng tròn nhỏ được khắc trên bề mặt trên cùng để hỗ trợ căn giữa tụ quang.

Việc căn giữa được thực hiện với vật kính có công suất thấp (10x-20x) bằng cách chụp ảnh vòng tròn được khắc và sử dụng các vít căn giữa tụ quang để đảm bảo vòng tròn (và tụ quang) được căn chính xác vào đường quang. Để biết thông tin chi tiết hơn về căn chỉnh kính hiển vi để chiếu sáng trường tối, hãy tham khảo phần về cấu hình kính hiển vi trường tối ở nơi khác trong tài liệu hướng dẫn về kính hiển vi.

Nhìn chung, các vật thể được chụp trong điều kiện chiếu sáng trường tối thích hợp khá ngoạn mục để nhìn (ví dụ: hãy thử một giọt máu tươi trong trường tối). Thường thì các mẫu vật có độ tương phản vốn có rất thấp trong kính hiển vi trường sáng sẽ sáng rực rỡ trong trường tối. Chiếu sáng như vậy là tốt nhất để làm lộ các đường viền, cạnh, ranh giới và độ dốc chiết suất. Thật không may, chiếu sáng trường tối ít hữu ích hơn trong việc làm lộ các chi tiết bên trong.

Các loại mẫu vật khác, bao gồm nhiều loại được nhuộm màu, cũng phản ứng tốt với ánh sáng trong điều kiện trường tối. Hình 7 minh họa ảnh chụp vi thể trường tối của ba loại mẫu vật, tất cả đều tạo ra độ tương phản tốt trong cả điều kiện chiếu sáng trường sáng và trường tối. Các chi tiết trong cơ thể của ve hươu ( Ixodes demmini ) được hiển thị trong Hình 7(a) có thể bị trôi trong trường sáng, trừ khi khẩu độ tụ quang được thu nhỏ lại để tối đa hóa độ tương phản. Tuy nhiên, trong trường tối, hầu hết các chi tiết của mẫu vật trong ve trở nên có thể nhìn thấy được và có thể dễ dàng chụp trên phim. Sán lá gan lớn nhuộm màu nhiều ( Echinostoma revolutum , Hình 7(b)) cũng cho thấy nhiều chi tiết hơn đáng kể khi được chiếu sáng trong điều kiện trường tối, cũng như khí quản và lỗ thở của tằm được minh họa trong Hình 7(c). Ngoài các ví dụ được trình bày ở trên, một số mẫu vật khác cũng có thể được xem và chụp ảnh trong cả điều kiện chiếu sáng trường sáng và trường tối để đạt được hiệu ứng mong muốn.

Trong nửa đầu thế kỷ XX, kính hiển vi trường tối có lượng người theo dõi rất đông đảo và đã bỏ ra nhiều công sức để tối ưu hóa tụ quang trường tối và đèn chiếu sáng. Sự quan tâm sâu sắc này dần dần phai nhạt khi xuất hiện các kỹ thuật tăng cường độ tương phản tiên tiến hơn như độ tương phản pha, độ tương phản giao thoa vi sai và độ tương phản nổi Olympus.

Kính hiển vi trường tối vẫn là một công cụ tuyệt vời cho cả nghiên cứu sinh học và y tế. Nó có thể được sử dụng hiệu quả ở độ phóng đại cao để chụp ảnh vi khuẩn sống hoặc ở độ phóng đại thấp để xem và chụp ảnh tế bào, mô và toàn bộ vật thể. Các nhà sinh vật học biển tiếp tục sử dụng chiếu sáng trường tối ở công suất thấp để quan sát và ghi lại dữ liệu về các sinh vật nước ngọt và nước mặn như tảo và sinh vật phù du.